众所周知,外泌体在很多生理病理上起着重要的作用,如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等;同时,外泌体与疾病诊断、预后等密切相关,因此也可以作为分子标志物;当然,外泌体经过一定修饰后,可作为载体将包裹在其内的药物/货物运送到特定靶标组织或区域。

下面我们来为大家分别介绍2篇近期发表的外泌体小RNA测序研究方法,一个方法是为机制机理研究方向,另一外泌体研究方法为分子标志物研究方向。

外泌体研究方法:【文献一】

 

该研究由南京大学医学院附属鼓楼医院的学者完成,题目:间充质基质细胞来源的外泌体通过miR-182调节巨噬细胞极化减弱心肌缺血再灌注损伤。

研究背景

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)逐渐成为调节心脏炎症的有力候选者,MSCs分泌的外泌体可能是心肌梗死后MSCs移植起作用的新机制。作者探讨了MSC来源外泌体(MSC-Exo)在心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)后巨噬细胞免疫调节中的作用及其在心脏损伤修复中的意义。

主要研究方法

使用梯度离心法从MSC的上清液中分离外泌体(MSC-Exo);

在心肌缺血/再灌注(I/R)之前和之后24小时施用巨噬细胞清除剂-二氯亚甲基二膦酸盐(Cl2MDP)脂质体,再灌注后0h立即递送MSC-Exo或PBS在至心肌。检测梗塞面积以及心脏和血清中的炎症水平等;

流式细胞检测分析巨噬细胞M1和M2比例;

MSC-Exo miRNA测序分析鉴定巨噬细胞极化的有效候选分子和其靶基因。

研究结果

在心肌I/R后通过心肌内注射给小鼠施用MSC-Exo减少了梗塞面积并减轻了心脏和血清中的炎症水平;

用巨噬细胞清除剂-二氯亚甲基二膦酸盐(Cl2MDP)脂质体消除了MSC-Exo的疗效;

MSC-Exo在体内和体外均调节促炎的M1巨噬细胞向抗炎的M2巨噬细胞极化;

MSC-Exo-miRNA-seq揭示miR-182可能作为巨噬细胞极化的有效候选介质,以及其下游靶基因TLR4。敲低MSC-Exo中miR-182部分减弱其对巨噬细胞极化的调节,TLR4的敲低也赋予心肌I/R小鼠模型中的心脏保护功效并降低炎症水平。

 

外泌体研究方法:【文献二】

 

该研究由中央民族大学生命与环境科学学院/转化神经科学研究中心负责人程勇教授领导课题组完成,题目:全基因组整合分析提示精神分裂症外泌体来源的miRNA失调。

研究背景

精神分裂症(schizophrenia,SCZ)风险相关的遗传变异已经被广泛研究了,但是SCZ相关的转录后机制尚未得到很好的研究。并且这些遗传变异通常是微效的。除遗传因素外,越来越多的证据表明表观遗传学可能参与SCZ的发病机制。已知的表观遗传标记中,microRNAs(miRNAs)在过去十年中备受关注,已被证明在神经发育和中枢神经系统的维持中发挥关键作用,例如神经分化、突触可塑性和认知功能。以往的研究提示miRNA可作为各种神经精神疾病的潜在生物标志物。

方法和结果

1、miRNA筛选:

血清exo-miRNA-seq,49个第一次发作未用药的SCZ患者 vs 46个HC对照;

1)training set:23个SCZ患者 vs 23个HC对照,鉴定高表达(TPM≥10)的、显著差异表达(FDR<0.05)且差异倍数较高(FC≥2)DEmiRNAs:hsa-miR-206、hsa-miR-145-5p和hsa-miR-133a-3p。

2)testing set:26个SCZ患者 vs 23个HC对照,鉴定高表达(TPM≥10)的、显著差异表达(FDR<0.05)且差异倍数较高(FC≥2)DEmiRNAs共计7个,包括前面training set的3个DE miRNA。

3)pooled set:综合上述2个set,共计6个miRNA符合上述条件:6 miRNAs (hsa-miR-206、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-144-5p、hsa-miR-144-3p和hsa-miR-184)。

2、随机森林分类器鉴定SCZ诊断分子标志物:

使用training set鉴定到一组11个miRNA,其AUC(Area Under Curve)为0。94 (95% CI, 0。88–1。0),敏感性0。783,特异性0。957。

testing set中验证该组11个miRNA的敏感性为0.769,特异性为0.783,AUC 为0.753 (95% CI,0.61–0.90)。

3、SCZ外泌体miRNA共表达模块分析:

上述pooled set(49个SCZ患者 vs 46个HC对照)进行miRNA WGCNA分析,共计鉴定到11个共表达的模块,其中3个与疾病状态显著相关。

4、DE miRNA以及SCZ相关miRNA共表达模块靶基因通路和功能富集分析:

比如hsa-miR-206,其是SCZ患者的血液外泌体中最显著上调的miRNA,并且之前报道其调节脑源性神经营养因子BDNF表达。显著相关miRNA共表达模块靶基因显著富集到了O型聚糖的生物合成等通路,GO富集到了神经递质转运蛋白、树突棘和树突发育相关term。

4、qRT-PCR验证DEmiRNA表达及其靶基因表达验证:

qRT-PCR验证:100个SCZ患者(57例第一次发作未用药患者FEDF和43例长期治疗患者CT)vs 100个对照对于hsa-miR-206、hsa-miR-144-3p其验证结果与二代测序一致,且经过长期治疗在CT组其水平会向正常组趋近。靶基因表达和elisa结果显示SCZ患者血液中BDNF mRNA和蛋白质水平降低。greenyellow模块中靶基因GALNT8和GALNT15也显著降低。

文献一:Zhao J, Li X, Hu J, et al. Mesenchymal Stromal Cell-Derived Exosomes Attenuate Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury through miR-182-Regulated Macrophage Polarization[J]. Cardiovascular Research, 2019.

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文献二:Du Y, Yu Y, Hu Y, et al. Genome-Wide, Integrative Analysis Implicates Exosome-Derived MicroRNA Dysregulation in Schizophrenia[J]. Schizophr Bull. 2019 Feb 16.

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