本文为大家分享一个基于nanopore平台检测新合成isoform及其稳定性的技术。

真核基因通常产生多种RNA isoform,其可产生功能上不同的蛋白质变体。然而,RNA isoform的合成和稳定性鲜少了解。原因是目前量化RNA代谢的方法是不能检测RNA isoform的“短读长”测序。

因此作者开发了nano-ID(nanopore sequencing-based Isoform Dynamics ),其结合了代谢RNA标记、天然RNA分子的“长读长”纳米孔测序和机器学习。

一个主要挑战是寻找合适的核苷类似物用于RNA标记和检测标记的RNA isoform,已知标记效率限制在约2-3%,即100个天然核苷酸中只有2个或3个被核苷酸类似物取代。作者利用ERCC标准品,分别以添加核苷酸类似物和不添加的天然碱基作体外转录,将体外转录产物进行nanopore direct RNA测序,比较了几种不同的核苷酸类似物:5EU(5-Ethynyluridine,5-乙炔基尿苷)、5BrU(5-bromouridine,5-溴尿苷)、5IU(5-iodouridine,5-碘尿苷)、4sU(4-thiouridine,4-硫代尿苷)和 6sG(6-thioguanine,6-硫鸟嘌呤)。最终结果表明:5EU和5IU标记检出率比较高,且5EU对细胞无毒性。且5EU标记的新合成RNA中约有一半U可以被识别为5EU,且从原始电信号中可以明显区分5EU和天然U碱基。选用5EU进行体内实验。

整体的nano-ID方法如下,作者在人慢性髓系白血病细胞系K562中进行了体内研究:5EU处理60min组、5EU处理24h组和未处理组。同时,作者进行了polyA长度分析。

热休克反应(42°C 60min)处理,许多RNA isoform改变了合成速率、稳定性和剪接模式。nano-ID分析结果表明,对于某一个基因座对应的组合RNA混合物(基因水平)的代谢变化与单一转录本代谢变化差异非常大。虽然组合的RNA稳定性与poly(A)尾巴长度相关,但是单个RNA isoform可以显著偏离。nano-ID能够在不同细胞状态和条件下研究单个RNA分子和isoform水平的RNA代谢。

【参考文献】

Maier K C, Gressel S, Cramer P, et al。 Native molecule sequencing by nano-ID reveals synthesis and stability of RNA isoforms[J]。 bioRxiv, 2019: 601856。

 

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